ในการสกัดเบต้ากลูแคนจากผนังเซลล์ยีสต์นั้นสามารถทำ ได้หลายวิธี เช่น alkali-acid hydrolysis, enzyme digestion และ ultrasound (Sandula และคณะ, 1999) เบต้ากลูแคน ที่ได้จากการสกัดแต่ละวิธีจะมีความบริสุทธิ์แตกต่างกัน โดยมีปริมาณสารที่เป็น intracellular molecule ปนเปื้อนอยู่ในปริมาณแตกต่างกัน ในขั้นแรกของการสกัดต้องมีการทำ ให้เซลล์แตก และแยกส่วนของผนังเซลล์ออกมา วิธีการทำ ให้เซลล์แตกมีอยู่หลายวิธี ดังนี้
วิธีการทำ ให้เซลล์แตก
1. โดยวิธีทางกายภาพหรือทางกล
วิธีนี้อาศัยหลักการในการทำ ให้เซลล์แตกและเก็บเกี่ยวผลผลิตที่อยู่ภายในเซลล์ แล้วจึงนำผลผลิตที่ต้องการมาสกัดต่อในภายหลัง ผนังเซลล์ของยีสต์มีความแข็งแรง จึงต้องใช้วิธีทางกลหรือใช้สารเคมีเพื่อทำ ให้เซลล์แตก อย่างไรก็ตามควรเลือกใช้วิธีที่ป้องกันการทำ ให้สารที่ต้องการเสียสภาพไปและถูกย่อยสลายโดยเอนไซม์ภายในเซลล์
ในการสกัดแยกผนังเซลล์ อาจใช้วิธีในการทำ ให้เซลล์จุลินทรีย์แตกด้วยวิธีทางกล โดยใช้เครื่องโฮโมจีไนซ์หรือลูกแก้ว (glass beads, ball mill) เครื่องโฮโมจีไนซ์ที่ใช้มีความดันสูงถึง 20,000 ปอนด์ต่อตารางนิ้ว ทั้งชนิด French Press, Eaton Press และ Gualin Homogenizer โดย Gualin Homogenizer จะออกแบบให้มีขนาดและใช้ปริมาตรของเหลวในปริมาณน้อยๆ ได้ จำนวนครั้งที่ผ่านเครื่องสามารถปรับได้ตามความต้องการที่จะทำให้เซลล์แตก ตัวเครื่องประกอบด้วยปั๊มผลักดันแทนที่ (positive displacement pump) เป็นส่วนดันให้ของเหลวข้นของยีสต์ ผ่านช่องเล็กๆ เกิดแรงเฉือนทำ ให้เซลล์แตกหรือฉีกขาด สารต่างๆ ภายในเซลล์จะถูกปลดปล่อย ออกมา ผลิตภัณฑ์ที่ได้เป็นส่วนผสมของโปรตีน กรดนิวคลีอิก และชิ้นส่วนของผนังเซลล์ (Jazwinski, 1990) การทำลายเซลล์โดยวิธีนี้ มีข้อเสียเนื่องจากเซลล์ถูกทำลายค่อนข้างสมบูรณ์ ทำให้การแยกชิ้นส่วนของเซลล์ออกจากของเหลวทำ ได้ยาก กรดนิวคลีอิกที่ถูกปลดปล่อยออกมา จะมีผลทำให้ความหนืดของสารละลายเพิ่มขึ้น รวมทั้งชิ้นส่วนของผนังเซลล์ที่อยู่ในสารละลาย มีผลต่อการทำให้ใสในส่วนของสารสกัดยีสต์ (Asenjo และ Andrews, 1990)
1.1 เทคนิคที่ใช้ Homogenizer
เทคนิคนี้นิยมใช้ในอุตสาหกรรมนม ต่อมามีการนำไปประยุกต์เพื่อทำ ให้เซลล์จุลินทรีย์แตก โดยมีวิธีการคือ ผ่าน cell suspension เข้าไปในเครื่อง homogenizer แล้วเพิ่มแรงดันเพื่ออัดให้ cell suspension ไหลผ่านช่องแคบๆ ระหว่างวาล์วและวงแหวนประกับ เมื่อ cell suspension ถึงปลายทางออกทำ ให้แรงดันลดลงอย่างรวดเร็ว ซึ่งส่งผลทำ ให้ผนังเซลล์ฉีกขาดได้ หรือเรียกว่า เกิดจากแรงเฉือน (liquid shear) ซึ่งประสิทธิภาพในการทำ ให้เซลล์แตกขึ้นอยู่กับความแตกต่าง ของแรงดันที่ใช้ จากงานวิจัยของ Hunter และ Asenjo, (1988) ได้ศึกษาการใช้ homogenizer โดยใช้ cell suspension ที่มีเซลล์ยีสต์ 60% ที่แรงดัน 550 kg/cm3 ผลคือ สามารถทำให้ เซลล์ยีสต์แตกได้ 90% และนอกจากนี้ยังทดลองใช้กับเชื้อชนิดอื่น เช่น แบคทีเรีย รา เป็นต้น เพื่อสกัดเอนไซม์ภายในเซลล์แต่มีความจำ เป็นต้องทำ cell suspension ที่อุณหภูมิ 0-4 °C ก่อนผ่านเข้าเครื่อง homogenizer เพื่อลดการสูญเสียความสามารถของเอนไซม์จากความร้อน ที่เกิดขึ้นระหว่างกระบวนการ
1.2 เทคนิค French Press
เป็นเทคนิคสำ หรับการทำ ให้เซลล์หรือผนังเซลล์แตก เช่น chloroplast material เซลล์เม็ดเลือด เซลล์จุลินทรีย์ เซลล์เนื้อเยื่อของพืชและสัตว์ รวมทั้ง biological particles เป็นต้น หลักการทำ ให้เซลล์หรือผนังเซลล์แตกด้วยเทคนิค French Press เกิดจากการเพิ่มแรงดันภายหลังบรรจุ cell suspension ลงใน motor-driven piston ทำ ให้แรงดันภายใน motor-driven piston สูงขึ้นตามระดับที่ต้องการ หลังจากนั้น cell suspension จะถูกปล่อยออกทางช่องแคบๆ เรียกว่า sample outlet tube ด้วยอัตราเร็วประมาณ 1ml/min ขณะที่ cell suspension ถูกฉีดออกจาก motor-driven piston แรงดันภายในจะลดลงอย่างรวดเร็ว ซึ่งจะทำ ให้เซลล์หรือผนังเซลล์ฉีกขาด เรียกว่า เกิดแรงเฉือน ผลที่เกิดขึ้น โมเลกุลของสารต่างๆ จะถูกปลดปล่อยออกมาภายนอกเซลล์ จากนั้นจึงทำการแยกเก็บผนังเซลล์โดยวิธีการปั่นเหวี่ยงแยก intracellular molecular
2. โดยวิธีใช้เอนไซม์
เอนไซม์หลายชนิดสามารถย่อยผนังเซลล์จุลินทรีย์และทำ ให้เซลล์แตกได้ เช่น ไลโซโซม์เอนไซม์จากหอยทาก เอนไซม์จากเม็ดเลือดขาว เป็นต้น และเอนไซม์ที่สกัดได้จากจุลินทรีย์ เช่น Streptomyces spp., Micromonospora spp. และ Trichoderma spp. เป็นต้น แม้ว่าการใช้เอนไซม์เพื่อการทำ ให้เซลล์แตกจะได้สารสกัดที่มีความบริสุทธิ์สูง แต่ต้นทุนในการผลิตก็สูงตาม
ไปด้วย ดังนั้นจึงไม่นิยมนำ มาใช้ในระดับอุตสาหกรรม
3. โดยวิธีทางเคมี
การใช้สารเคมีบางชนิดย่อยสลายยีสต์ สามารถแบ่งออกเป็น 2 กระบวนการใหญ่ๆ คือ
3.1 พลาสโมไลซิส (plasmolysis) เป็นวิธีที่ง่ายสำ หรับการทำลายเซลล์ยีสต์ โดยการใช้สารพลาสโมไลส์ ส่วนมากจะเป็นตัวทำละลายอินทรีย์ที่ไม่มีขั้ว เช่น โทลูอีน คลอโรฟอร์ม ไอโซโพรพานอล และอะซีเตทเอสเทอร์ เป็นต้น หรือใช้สารละลายอินทรีย์จำ พวกนำตาลที่มีความเข้มข้นสูงๆ โดยไม่มีการทำ งานของเอนไซม์เข้ามาเกี่ยวข้อง สารที่นิยมใช้คือ โซเดียมคลอไรด์ โดยเมื่อเซลล์ยีสต์อยู่ภายใต้สภาพความเข้มข้นสูงๆ ของสารดังกล่าว จะมีผลต่อแรงดันออสโมติก ของเซลล์ยีสต์ทำ ให้เกิดการสูญเสียสมดุลนำ ในเซลล์ในภาวะนี้พลาสมาเมมเบรนของยีสต์ จะหดตัวลง เกิดความเสียหายและเกิดการรั่วไหลขององค์ประกอบภายในเซลล์ออกมา ยีสต์จะตาย และเป็นจุดเริ่มต้นของการสลายตัวเองของยีสต์ (Reed และ Nagodawithana, 1991) ทำให้ สามารถแยกผนังเซลล์ได้
3.2 ไฮโดรไลซิส (hydrolysis) เป็นการย่อยสลายเซลล์ยีสต์ โดยวิธีการใช้กรดเกลือเข้มข้นร่วมกับความร้อน เพื่อใช้ในการย่อยสลายสารโมเลกุลใหญ่ภายในเซลล์ เช่น คาร์โบไฮเดรต โปรตีน และกรดนิวคลีอิก เป็นต้น ให้อยู่ในรูปสารโมเลกุลเล็กละลายนำ ได้ดีขึ้น วิธีนี้สามารถใช้ได้กับยีสต์ ที่ไม่มีชีวิตหรือยีสต์แห้งและใช้เวลาสั้น (ประมาณ 6-8 ชั่วโมง) ทำการควบคุมภาวะให้มีความเหมาะสม โดยควบคุมอุณหภูมิให้สูงหรืออาจใช้ความดันเข้ามาเกี่ยวข้องในสภาวะกรด
4. โดยเอนไซม์ภายในเซลล์ (Yeast Autolysis)
การย่อยสลายตัวเองของยีสต์ (self digestion หรือ autolysis) สามารถเกิดขึ้นเองตามธรรมชาติ แต่สามารถกระตุ้นให้เกิดเร็วขึ้นได้โดยควบคุมภาวะต่างๆ ได้แก่ อุณหภูมิ ความเป็นกรดด่าง เวลา และความเข้มข้นให้เหมาะสม ซึ่งภายใต้ภาวะที่เหมาะสมแก่การย่อยสลายตัวเองของยีสต์ ระบบเอนไซม์สำคัญที่ทำ หน้าที่ควบคุมเมตาบอลิซึมปกติของยีสต์ จะทำงานผิดไป ส่งผลให้เซลล์ยีสต์เริ่มตายและเกิดการย่อยสลายตัวเองของเซลล์อย่างช้าๆ พร้อมทั้งปล่อยเอนไซม์ภายในแวคิวโอล (Vacuole) ออกมาทำ หน้าที่ในการย่อยสลายสารโมเลกุลใหญ่ เช่น โปรตีนกรดนิวคลีอิก เป็นต้น ไปเป็นสารโมเลกุลเล็กที่สามารถละลายได้ ผนังเซลล์จะสูญเสียสภาพที่เป็นเยื่อเลือกผ่านและปล่อยให้สารประกอบต่างๆ ภายในเซลล์ออกมาภายนอกเซลล์ได้
ที่มา | หนังสือ เบต้ากลูแคน (Beta Glucan) “สนับสนุนระบบภูมิคุ้มกันที่ดีที่สุด เท่าที่มนุษย์เคยค้นพบมา” โดย รศ.ดร. องอาจ ผ่องลักษณ์สนใจหนังสือเบต้ากลูแคน ติดต่อที่ 02-147-5900-1 คุณ ลัดดา (กุ้ง) ฟรี ค่ะ
1,094 total views, 3 views today
